Innehåll
Lise är ett grekiskt ord och betyder helt enkelt "att dela upp" eller "att sönderfalla". Det är en bra beskrivning av reaktionen som sker med celler i en lysbuffert, en lösning som bryter ner dem för att extrahera innehållet. Forskare använder dessa lösningar för att extrahera DNA eller proteiner i cellanalys, särskilt när det gäller bakterier. Typen av celllysbuffert varierar beroende på typen av experiment, men vi kommer att nämna några vanliga val.
Buffert och salt
Buffertlösningarna stabiliserar pH, medan cellerna genomgår lyseringsprocessen. Tris-HCL-lösningen är den vanligaste bufferten för buffring vid pH 8, om pH önskas. HEPES är en annan vanlig buffertlösning i dessa experiment. Natriumklorid kan också tillsättas för att öka jonstyrkan, den totala koncentrationen av lösta ämnen utanför cellerna. Det senare är viktigt eftersom vatten kan spridas till alla cellmembran, från regioner med låg koncentration av lösningsmedel till de med hög koncentration.
Rengöringsmedel
Detergent är den viktigaste ingrediensen som löser upp cellmembranet så att innehållet kan fly. Rengöringsmedel är amfipatiska molekyler, det vill säga med ena änden som enkelt interagerar med vattenmolekyler medan den andra hydrofoba änden, eller "som är rädd för vatten", inte gör den interaktionen. De kan lösa upp fetter genom att bilda miceller, små grupper, i vilka tvättmedelsmolekylernas hydrofoba svansar pekar inåt mot fettmolekylerna. Vanliga rengöringsmedel är natriumdodecylsulfat eller SDS, NP-40 och tritonX.
Kelateringsmedel och hämmare
Lysbuffertar innehåller vanligtvis också kelatbildande medel såsom etylendiamintetraättiksyra (EDTA) eller retylenglykoltetraättiksyra (EGTA). Dessa kemikalier binder till metalljoner med en +2 laddning (till exempel magnesium och kalcium), vilket gör dem otillgängliga för andra reaktioner. Många DNAser (proteiner som tuggar DNA) och proteaser (proteiner som skär andra proteiner) behöver magnesiumjoner för att fungera, så genom att beröva dem denna huvudingrediens, EDTA och EGTA, hjälper de till att minska nivån av proteas eller av DNAse-aktivitet. Men de utesluter dem inte helt, och vissa proteaser beror inte på magnesiumkofaktorer, så lysbuffertar innehåller ibland också ämnen som kallas proteashämmare, som binder till det och förhindrar att det fungerar korrekt.
Alkalisk lysis
Alkalisk lys är en mycket vanlig teknik för att rena plasmider från bakterier. Denna metod innebär att man använder tre lösningar. Den första innehåller glukos, tris-HCL-buffert, EDTA och RNAses. Glukos skapar en hög koncentration av upplösta bakterier utifrån, så att de blir svaga, vilket underlättar lysprocessen. EDTA och tris-HCL fungerar som tidigare beskrivits, medan RNAse kommer att tugga allt RNA inuti cellen för att få det ur vägen. Den andra lösningen gör effektivt celllys. Den innehåller tvättmedlet SDS och NaOH, som höjer pH till 12 eller högre, denaturerar proteinerna inuti cellen och får DNA att separeras i enkla trådar. Den tredje lösningen innehåller kaliumacetat för att återställa pH till en mer neutral nivå så att plasmid-DNA-strängarna kan komma ihop. Under tiden samlas de denaturerade proteinerna och fälls ut, medan dodecylsulfatjoner förenas med kaliumjoner för att bilda en olöslig förening, som också kan fällas ut ur lösningen.